组蛋白上不同位点的赖氨酸甲基化可以调控基因的表达，具体取决于甲基化的位点及程度 （即单甲基化、二甲基化或三甲基化） 。效应蛋白 （或“阅读器”） 是识别组蛋白甲基化并将相关信息传递到下游事件，以调控基因表达的关键因素。到目前为止， 除了组蛋白H3赖氨酸79 （H3K79） 的甲基化外，几乎所有组蛋白甲基化标记的阅读器均已被报导。 在哺乳动物中，DOT1L是唯一的催化H3K79甲基化的甲基转移酶 【1】 。DOT1L介导的 H3K79甲基化在活跃转录的基因中富集，并参与了转录延伸、DNA损伤修复和细胞周期的调控。在高等真核生物中，H3K79甲基化水平在胚胎发育和造血过程中受到了精准的调控 【2】 。例如，小鼠胚胎中H3K79甲基化的扰动可以导致心血管缺陷及贫血 【3】 。而H3K79的高甲基化也是在混合谱系白血病 （MLL） 患者中诱发白血病的重要因素 【4】 。尽管H3K79甲基化具有许多重要功能，但由于缺乏对H3K79甲基化“阅读器”的认识，我们依然无法解释这种组蛋白修饰到底如何调控并参与到相关的下游事件当中。 自从H3K79甲基化修饰于2002年发现以来，研究人员进行了大量尝试来寻找其“阅读器”，但在过去的二十年却始终未能有实质的突破。究其原因有二：一方面是H3K79及其甲基化的识别很可能依赖于完整核小体的四级结构。因为不同于位于末端的组蛋白修饰，H3K79位于核小体的核心区域。事实上，DOT1L仅可甲基化完整核小体中的H3K79，而不是H3多肽或组蛋白 【5】 。正因如此，通常采用的基于组蛋白多肽片段的亲和下拉实验就很难找到H3K79甲基化的阅读器。另一方面，组蛋白翻译后修饰介导的蛋白相互作用常常是微弱的、瞬时的，也为H3K79甲基化“阅读器”的鉴别增加了难度。正因如此，开发一个新的工具来克服这些传统生物学方法无法解决的难点迫在眉睫。 2023年2月16日，香港大学化学系李祥 课题组与生物科学学院翟元樑 博士、生物医学学院黃永瀚 博士、鲍秀丛 博士合作，在Science Menin ‘reads' H3K79me2 mark in a nucleosomal context 。在该研究中， 作者开发了一种基于核小体的光亲和探针，用来捕获在核小体环境下识别 H3K79 二甲基化（H3K79me2）的蛋白质。结合定量蛋白质组学方法，该探针成功鉴别了menin为H3K79me2的“阅读器”。 作者还运用冷冻电子显微镜技术，解析了menin与H3K79me2核小体复合物的结构。通过染色质免疫沉淀结合高通量测序技术 （ChIP-Seq） ，作者发现menin与H3K79甲基化标记在大量基因上存在共定位，而进一步的生物信息学分析显示，menin可能富集于被H3K79甲基化标记的基因增强子上，参与了基因转录的调控。总体而言，该文章使用化学方法，解决了困扰研究人员20多年、传统生物学方法无法解决的生物问题，标志着着化学生物学的一次胜利。 图1：（A）H3K79me2核小体探针示意图；（B）运用CLASPI鉴别H3K79me2修饰的阅读器；（C）menin在正向与反向CLASPI实验中脱颖而出；（D）menin-H3K79me2核小体复合物的分子结构。 文章中，作者首先针对鉴别H3K79me2“阅读器”过程中可能面临的难点，设计并合成了一种多功能的核小体探针，在核小体中H3K79位点上特异性地引入了化学计量水平的二甲基化。同时，该探针还拥有一个可双向洗脱的多功能光亲和基团，其中包含可实现光交联的双吖丙啶 （diazirine） ，可通过点击化学 (click chemistry) 富集、分离交联蛋白的炔基 （alykne） ，以及可用于释放交联肽进行质谱分析的二硫键 （图1A） 。为了确保光交联的效率和特异性，这个三功能基团被放置于H3D81。根据核小体的晶体结构，该位置既靠近H3K79，又不太可能干扰核小体内的组蛋白-组蛋白或组蛋白-DNA的相互作用。 结合SILAC质谱分析技术 （CLASPI） ，作者在细胞核提取液中检测到了menin可选择性地被H3K79me2核小体探针的结合 (图1，B-C) 。随后，作者运用单核小体下拉验证了menin与H3K79me2核小体可以在细胞内的结合。作者还于体外验证了menin可以选择性地结合带有H3K79me2修饰的核小体，不含H3K79me2修饰的核小体与menin结合的亲和力显著降低。 图2：（A-D）menin通过Fingers和Palm结构域与H3K79me2核小体结合；（E）menin通过π–阳离子相互作用来结合H3K79me2；（F）menin-H3K79me2核小体和 menin-MLL1-LEDGF结构的叠加；（G）在基因体中menin和H3K79me2的ChIP-Seq信号。（H）H3K79me2、H3K4me3、MLL1与menin的ChIP-seq信号在基因体不同区间的线性回归系数。
为了了解menin具体是如何识别核小体上的H3K79me2修饰的，作者使用低温电子显微镜 （cryo-EM） 解析了复合物的结构 （图 1D） 。作者发现，menin主要通过其Fingers和Palm结构域与H3K79me2核小体结合。H2B与H3均参与了核小体与menin的相互作用，这些相互作用共同将menin置于识别H3K79me2侧链的位置，并通过H433的π–阳离子相互作用来稳定H3K79me2的甲基铵基团 （图 2，A-E） 。与该观察结果一致，与野生型蛋白相比，H3K79me2核小体探针对menin H433A突变蛋白的交联效率大大降低，证明了menin的H433对于识别核小体上的H3K79me2起关键作用。值 得注意的是，与组蛋白末端赖氨酸甲基化的“阅读器”不同，后者通常使用由两到四个芳香族残基构成的“芳香族笼”捕获甲基铵部分，而menin仅使用H433的一个芳香族残基来识别H3K79me2，这说明menin与核小体的组蛋白H3和H2B的多位点相互作用可能可以增强对H3K79me2的识别，也因此，H3K79me2的识别需要完整的核小体环境。 作者还对已知的menin-MLL1-LEDGF （PDB: 3U88） 【6】 的晶体结构与menin-H3K79me2核小体结构进行了比对 （图F） 。分析表明，menin可能可以同时结合核小体和MLL1-LEDGF而不会出现空间冲突。事实上，基于MLL1的多肽以及已知的menin-MLL1抑制剂在作者的光交联实验中未能抑制menin与H3K79me2核小体的相互作用。另外，menin和MLL1之间的相互作用也不受menin的H3K79me2识别残基 （H433A） 突变的影响，证明menin具有两个独立的 MLL1 和 H3K79me2 核小体结合口袋。总之，这些结果表明 menin可能对于募集其相关的结合因子 （例如JunD或MLL1） 到染色质具有重要作用。 最后，为了证明在细胞内menin可以识别染色质上的H3K79me2修饰，作者在MCF-7 细胞中进行了menin以及H3K79me2修饰的ChIP-Seq分析。结果显示，menin与H3K79me2修饰在大量基因位点上存在共定位，进一步的分析显示相比于启动子区域，定位在基因体上的menin的富集程度与H3K79me2修饰的水平呈现明显的正相关关系 （图2，G-H） 。进一步的生物信息学分析发现，menin很可能通过识别H3K79me2修饰从而富集在被H3K79me2修饰标记的增强子上，进而调控基因的转录。作者推测， menin与H3K79me2修饰在增强子上的作用可能是一种新的基因转录调控通路，而揭示这一基因调控通路的更多细节将对白血病等疾病的治疗具有重要意义。 据悉，香港大学化学系李祥教授、生物科学学院翟元樑博士、生物医学学院黃永瀚博士、鲍秀丛博士为该文章的共同通讯作者。香港科技大学生命科学部党尚宇博士也参与了该工作。香港大学化学系林剑威博士后、吴怡萍博士、田高飞博士后、香港科技大学生命科学部余大启博士后为该文章的共同第一作者。 朱冰 （中科院生物物理所）
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赖氨酸残基是组蛋白上发生共价修饰类型最多的氨基酸残基。赖氨酸甲基化和乙酰化修饰是研究最多的组蛋白修饰类型。由于生物物理性质的不同，赖氨酸甲基化和乙酰化功能实现途径有一个极大的不同。赖氨酸残基带正电荷，组蛋白尾巴上存在大量携正电荷的氨基酸残基，它们与DNA上的负电荷间形成的相互作用导致了染色质的致密化。乙酰化可以中和被修饰的赖氨酸残基携带的正电荷，从而削弱组蛋白尾巴与DNA间的相互作用，促进染色质结构的开放。换言之，赖氨酸乙酰化修饰本身就有着重要的功能，并不非得依赖乙酰化识别蛋白来行使其功能 （当然，乙酰化识别蛋白存在，也有其功能） 。与之形成鲜明反差的是，甲基化不能中和被修饰的赖氨酸残基携带的正电荷。因此赖氨酸甲基化修饰本身并不能行使其功能，其功能实现完全依赖于特异性的修饰识别蛋白 。因为这两种修饰的以上特点，所有的组蛋白乙酰化修饰 （以及其它的酰基化修饰） 都参与对基因表达的促进，而不同位点的组蛋白赖氨酸甲基化修饰则在功能上有着巨大的区别。
在目前研究最多的6种组蛋白赖氨酸甲基化修饰（H3K4,K9,K27,K36,K79和H4K20）中，H3K79甲基化修饰最为特殊，对其功能的理解也相对最为欠缺。不同于其它甲基化位点，H3K79并不位于组蛋白的尾巴上，而是位于H3的球形结构域中。其催化酶DOT1也是目前已知的唯一一个非SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基化酶。这6个位点的甲基化修饰及其修饰酶都在本世纪最初几年陆续被发现。二十多年来，H3K79位点是唯一一个至今未发现特异性甲基化识别蛋白和特异性去甲基化酶的位点，也是功能理解最为薄弱的一种甲基化修饰。
香港大学李祥教授课题组在Science 杂志的这一工作创新性地开发了一种化学生物学技术，能够对细胞内结合在核小体上的修饰识别蛋白进行共价交联 ，然后就可以通过后续的亲和纯化与质谱鉴定来发现特异性的修饰识别蛋白。这一技术较过去常用于寻找组蛋白修饰识别的peptide pull-down技术有一个重要的优势，可以做到对需要识别核小体结构特征的修饰结合蛋白的鉴定。利用该技术，李祥团队成功地鉴定到了Menin蛋白是H3K79二甲基化的识别蛋白，并进一步解析了复合体的电镜结构，揭示了Menin识别H3K79二甲基化的分子机制。
这一技术将会有着重要的应用前景，相信后续将有多种修饰结合蛋白会利用这一技术得以发现。从理论上讲，对这一技术进行适当衍生，还应该可以用于寻找组蛋白去修饰酶。
此外， 对于研究染色质修饰多年的人来说，Menin作为H3K79二甲基化修饰的识别蛋白是属于那种直觉上就“一眼真”的发现。 因为Menin是MLL1/MLL2类型组蛋白H3K4甲基化酶的亚基。这两种修饰之间的交互调控机制和意义将会是今后有趣的研究方向。
http://doi.org/10.1126/science.adc9318 1. F. van Leeuwen, P. R. Gafken, D. E. Gottschling, Cell 2. Y. Feng et al. , Blood 3. B. Jones et al. , PLoS genetics 4. K. M. Bernt et al. , Cancer Cell 5. Q. Feng et al. , Current biology : CB 12, 1052-1058 (2002). 6. J. Huang et al. , Nature
