2019.06.01 安尧分享 "SETDB1介导的AKT甲基化促进其激酶活性及致癌功能"的故事魏文毅教授课题组题为AKT methylation by SETDB1 promotes AKT kinase activity and oncogenic functions的论文中，研究人员通过利用通用的三甲基化赖氨酸（k-me3）抗体来富集非组蛋白的甲基化修饰蛋白，联合高分辨率串联质谱的检测与分析方法，发现了近千个赖氨酸甲基化位点，及对应的近百个新的可以被甲基化的蛋白。其中，他们发现了位于AKT1的linker区域（K140/K142）的赖氨酸三甲基化片段。 PI3K/AKT信号通路是被研究最多的一条促进肿瘤发生、肿瘤耐药和代谢改变的通路。生理条件（比如生长因子刺激、缺氧等）或病理条件（比如癌基因EGFR, RAS, PIK3CA突变或抑癌基因PTEN失活）的改变都可以显著的增强AKT的激酶活性。而活化的AKT通过磷酸化大量的底物（具有时间和空间的特异性）来调控细胞对这些改变的适应。而AKT的过激活是肿瘤、肥胖、糖尿病等疾病发生的重要因素之一。Wenyi Wei教授题组对AKT信号通路有过深入的研究，他们曾发现细胞周期蛋白CDK2可以直接磷酸化AKT尾端丝氨酸，从而以一种细胞周期依赖的方式激活AKT激酶 （Nature, 2014）；之后他们发现，在缺氧环境下，AKT不能被缺氧诱导因子（HIF）的羟基化酶EglN1进行羟基化修饰，从而不能被抑癌基因VHL识别，以阻止去磷酸化酶PP2A的抑制作用，从而阐明了AKT在实体瘤缺氧环境下或VHL突变的肾癌中激活的机制（Science, 2016）。 在确定AKT1上具有甲基化修饰后，研究人员对AKT1的甲基化修饰进行了验证和功能研究。首先，他们通过一系列体内和体外实验证实了AKT1确实可以被三甲基化，而通过构建甲基化缺失的AKT1突变体，可以显著降低AKT1的激酶活性，从而极大的抑制了AKT对生长信号的反应，在功能上抑制了肿瘤细胞的增殖、克隆形成及葡萄糖摄取、乳酸生成现象，最终影响了肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。为了进一步研究甲基化修饰对AKT体内功能的影响，通过CRISPR/CAS9技术，他们构建了甲基化缺陷的Akt1转基因小鼠，该小鼠表现出了体重减轻、脏器（肝脏、脾脏、肾脏）体积减小等Akt1敲除小鼠的性状，通过化学诱导的方法，他们进一步发现AKT1的甲基化缺失可以抵制化学诱导的方法生成的皮肤肿瘤的数量和大小，从而揭示了甲基化缺失对AKT1激酶活性的抑制作用。 通过分析一系列的甲基化酶和文献检索，他们利用多种方法证实了组氨酸甲基化酶SETDB1可以直接结合并甲基化AKT1。通过生物信息分析，他们发现SETDB1的基因扩增与PI3K/AKT通路的异常激活是相互排斥发生的（mutually exclusive），之后证实了SETDB1可以通过甲基化来激活AKT1信号通路。尽管以前报导SETDB1具有癌基因的功能促进黑色素瘤的发生，这里他们证实了敲除AKT1，或者敲入甲基化缺失的AKT1可以显著的抑制SETDB1的促肿瘤发生的能力，即SETDB1的癌基因功能主要是通过甲基化并激活AKT来实现的。 因为PI3K/PDK1是已知的、最重要的调控AKT-pT308和激酶活性的通路，因此他们进一步研究了SETDB1诱导的AKT甲基化和PI3K/PDK1诱导的AKT磷酸化之间的关系。在截短结合实验中，AKT的PH结构域被发现可以直接与SETDB1结合；在细胞实验中，PI3K的抑制剂可以抑制，而AKT1-E17K突变体可以促进AKT1与SETDB1的结合，因此他们推测PIP3诱导的AKT开放性结构可以促进AKT的PH结构域与SETDB1结合。为此，他们进行了体外结合实验，验证了这一假设，最终提出了PIP3打开AKT的锁状结构，促进PH结构域与SETDB1结合，而结合的SETDB1可以甲基化暴露的AKT1-linker区域。在linker区域发生的三甲基化修饰可以引起AKT蛋白位相结构的改变，促进PDK1的结合和AKT磷酸化的发生，最终AKT被激活。 在研究AKT甲基化的同时，魏文毅教授课题组也对AKT的去甲基化酶进行了鉴定和分析，他们发现KDM4家族中，KDM4B（JMJD2）可以结合并减少AKT1在K140/K142位点的甲基化修饰。同时KDM4B敲低的细胞系，具有更高的AKT激酶活性和对生长激素刺激的反应。而敲低SETDB1可以显著的抑制KDM4B与AKT的结合，这些发现证实了KDM4B可能是拮抗SETDB1介导的AKT甲基化的去甲基化酶。 在结论的最后，魏文毅教授课题组探讨了针对SETDB1的抑制对肿瘤治疗的潜在可能性。他们发现敲低SETDB1可以显著的抑制黑色素瘤在小鼠中的成瘤能力，同时伴随着AKT激酶活性的降低。由于缺乏特异性的SETDB1甲基化酶抑制剂，他们替代的使用了一种抗生素mithramycin A，这种抗生素被证实可以显著的在转录水平上抑制SETDB1的表达。mithramycin A的处理可以显著降低SETDB1蛋白表达和AKT激酶活性，同时抑制黑色素瘤细胞系在小鼠中的成瘤能力。他们同时指出了开发SETDB1特异的小分子抑制剂通过抑制AKT的激酶活性和激活H3K9me3介导的基因抑制对拮抗SETDB1扩增或激活的肿瘤具有显著的潜在临床效应。
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