2020.12.29 彭李缘分享TBK1调控DRP1在核酸刺激下介导线粒体动力学和生理学重编程的故事
Background
RNA sensing & RLR-MAVS pathway
MAVS：mitochondrial antiviral signaling protein
为了防御病原体感染和维持组织内稳态，后生动物通过模式识别受体部署先天免疫感知机制，以监测保守的病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMP)。如RIG-I样受体(RIG-I-like receptor，RLR)家族的RIG-I和MDA5的普遍表达，是这些监测系统的重要组成部分。其作用表现在可感应胞浆中的病毒RNA并触发信号级联反应，产生I型干扰素(IFN)，促进IFN诱导的大量干扰素刺激基因(ISGs)、条件炎性细胞因子和趋化因子的表达，以限制微生物感染，调节适应性免疫，并启动组织再生。
Mitochondrial fusion & fission
核酸天然免疫识别（Innate nucleic acid sensing）是一类在进化上高度保守的生物学机制，存在于机体几乎所有类型的细胞中。天然核酸感应的激活可以显著改变宿主细胞的生理过程和命运，并在一定条件下引发自身免疫和自身炎症性疾病。然而，天然核酸感应对细胞代谢、细胞器行为和细胞命运决定等细胞生物学功能的影响在很大程度上仍未确定。 线粒体是细胞的能量供应单位。线粒体动力学调控线粒体形态的持续和快速变化，在细胞能量代谢，细胞器完整和细胞命运决定等多个重要细胞生物学进程中发挥关键作用。但是，核酸天然免疫识别是否能主动控制线粒体的形态和功能尚不清楚。 Results
天然RNA感应是否能够调节线粒体的动力学以促进信号传递与适应其不同的功能尚不清楚。为了研究这种可能性，作者首先使用超分辨率显微镜对HEK293T细胞线粒体形态进行观察，发现细胞感染仙台病毒(SeV)后，线粒体出现大量延长和管状化。随后作者在不同类型的上皮细胞(HaCaT、NMuMG和HCT116细胞)中也发现了相同变化。为了排除病毒分子和缺陷干扰颗粒的影响，作者使用PolyIC（可诱发RNA感应）和50ppp-dsRNA（激活RIG-I）对细胞进行处理，发现PolyIC和50ppp-dsRNA也能诱导线粒体的融合（延长和管状化）。此外，作者发现过表达RIG-I、MAVS和TBK1都能引发HEK293T细胞线粒体融合；敲除MAVS以及双敲除 STING与MAVS后线粒体融合减弱。同样，在RIG-I/MDA5双敲除的HEK293T细胞中，SeV诱导的线粒体融合被完全中断。以上结果表明先天核酸感应通过RLR-MAVS通路来驱动线粒体融合。
随后，作者发现敲除TBK1/IKKε可阻断dsRNA引起的线粒体融合和IRF3激活，从而证明了天然RNA感应诱导的线粒体融合依赖于TBK1。此外，作者通过Phos-Tag电泳发现dsRNA引起介导线粒体裂变的DRP1发生迁移率改变，并且敲除DRP1显著促进发现线粒体融合。免疫共沉淀结果证明MAVS与DRP1、TBK1存在相互作用。截短突变结合免疫共沉淀表明，DRP1通过其N端结构域和MAVS结合。以上结果显示，RNA感应触发DRP1招募到MAVS信号小体，介导线粒体形态改变。
接下来作者通过纯化野生型(WT)和失活突变(K38A)的TBK1与DRP1蛋白，结合高通量质谱分析来探索TBK1磷酸化DRP1的位点，质谱结果显示多个DRP1位点可被TBK1磷酸化，其中S317、S412和S684变化最为明显。进一步体内外激酶实验证实DRP1是TBK1的直接底物。在天然RNA感应过程中，MAVS信号小体中的DRP1可被TBK1直接磷酸化。
为进一步评估DRP1磷酸化修饰对线粒体动力学的影响，作者在DRP1敲除的细胞中回补野生型（WT）或不同突变形式的DRP1。结果显示，敲除DRP1导致线粒体融合，而回补野生型（WT） DRP1后细胞内产生大量裂变线粒体；回补持续磷酸化突变的（S412D或S684D）DRP1后无法恢复线粒体裂变的表型；而不能被TBK1磷酸化修饰的DRP1突变体，包括S684A、S412A和S412A/684A，都能促进线粒体裂变且明显聚集在线粒体表面。以上结果表明，TBK1介导的DRP1 S412和S684位点的磷酸化可能通过调节DRP1在线粒体上的聚集来抑制线粒体分裂。 此外，作者发现， DRP1突变体(S412A、S684A及S412A/684A)多寡聚体形式蛋白量更高，而持续磷酸化DRP1突变体寡聚体蛋白表达量更少。TBK1活性存在时，DRP1的多聚形式显著降低；野生型DRP1的N端结构域与DRP1模拟磷酸化突变体的C端结构域之间的相互作用显著降低。以上结果表明，TBK1介导的磷酸化可抑制DRP1通过相互作用形成寡聚形式，从而阻止其在线粒体上的聚集。
接下来，作者探究了TBK1-DRP1信号轴和由此产生的线粒体融合在RLR-MAVS-IRF3信号通路中的作用。具有GTPase活性的野生型DRP1以剂量依赖的方式抑制TBK1诱导的IRF3转录激活，而DRP1抑制剂Mdivi-1可显著增强RIG-I刺激的IRF3激活。此外，小干扰RNA介导的DRP1表达缺失可以导致病毒感染时产生更强的抗病毒应答。HEK 293T细胞中DRP1的敲除同样增强了SeV感染后IFN-β和ISGs的mRNA表达。体外培养的肠道类器官中也得到了类似的观察结果。这些数据表明，DRP1介导的线粒体分裂是先天RNA感知的一个关键负调控因素，TBK1-DRP1调控的线粒体动力学在完整的MAVS信号体组装中至关重要。
随后作者研究了MAVS-TBK1-DRP1信号轴在细胞抗病毒防御中的作用。通过抑制DRP1活性可以显著增强HEK293T细胞对GFP-VSV的抗性。DRP1的缺失也显著增强了HEK293T细胞的抗病毒防御能力，这种防御能力能够被野生型DRP1或耐TBK1磷酸化修饰的DRP1突变体(S412A/684A)所抑制，但不能被DRP1模拟磷酸化突变体所抑制。进一步研究表明，葡萄糖缺乏或血清饥饿可激活TBK1并导致HCT116细胞出现明显的线粒体融合，干扰TBK1- DRP1信号可导致营养应激条件下严重的细胞死亡。这些数据表明，在营养应激条件下，TBK1-DRP1信号通路可通过调控线粒体动力学决定细胞命运。
为了评估TBK1-DRP1信号通路的生理效应，作者构建了DRP1 S684A、S684D（小鼠为Dnm1 S660A、S660D）突变基因鼠。DRP1 S684A纯合子的小鼠有活力和生育能力，表现正常。然而，从DRP1 S684A KI小鼠分离的腹膜巨噬细胞（PMs）对RNA的感应反应减弱。相反，杂合子DRP1 S684D KI小鼠表现出发育缺陷，数量远低于预期，在细胞中具有类似于DRP1 S684D的显性负效应。这些结果表明，TBK1介导的DRP1磷酸化在线粒体动力学中至关重要，对宿主抗病毒防御具有重要的生理意义。 此外，作者发现DRP1持续磷酸化突变的小鼠表现出早期死亡、与线粒体功能密切相关的多个器官衰竭，作者在这些小鼠肌肉中观察到线粒体过灌注和拉长。同时，小鼠胫骨前肌出现进行性骨骼肌萎缩，这可能是线粒体动力学和钙稳态受到干扰所致。以上结果表明，RNA感应触发的DRP1磷酸化是决定线粒体介导的生理功能的关键分子开关。
Graphical Abstract
该工作首次揭示了天然核酸免疫识别对线粒体这一关键细胞器的形态与功能控制，鉴定了RLR-MAVS-TBK1-DRP1通路与细胞器的信号耦合在RNA免疫识别中的关键作用，揭示了线粒体动力学以及DRP1蛋白活性的新调控机制，并深入解析了由MAVS-TBK1-DRP1-线粒体动力学这一信号轴主导的细胞和生理功能。这些新发现是核酸天然免疫生物学功能的重要进展，也为发展抗病毒和自身免疫疾病的防治手段提供了新的理论与实验依据。
文字：彭李缘，李磊 图片：彭李缘，李磊 编辑：贾文慧 校正：金萍 终审：周立
|
