2020.12.20 罗茂超分享“多聚泛素化链诱导的p62相分离促进自噬底物隔离”的故事

Background

1. 相分离的概念

2. 相分离的发展历史

2009年，德国马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所Tony Hyman教授在Science发表了题为Germline P granulesare liquid droplets that localize by controlled dissolution /condensation 的文章，发现线虫生殖细胞中的P颗粒（P Granules）具有液滴样性质。全球许多科学家都围绕细胞内的“相分离”展开研究。

2012年，美国德州大学Michael Rosen教授发现在试管中这些蛋白质或核酸可通过微弱的作用力发生相分离，提示“相分离”能够通过简单的生物化学方法在试管内重现。

2015年，加拿大多伦多儿童医院Julie Forman-Kay教授发现无序的Ddx4蛋白能够通过相分离在人体细胞中形成无膜细胞器，在这之后相分离研究进入井喷期。

3. 相分离的研究内容和检测手段

目前相分离相关研究主要集中于神经元细胞膜上的信号传递，基因表达以及液滴凝结成坚固蛋白质导致疾病等领域。如在神经细胞中，用于细胞间信号传递的蛋白质能够在连接处聚集，通过相分离保证细胞间信号传递正常进行；在细胞核中，相分离帮助压缩折叠不使用的DNA并抑制其活性，一些可能与转录相关的蛋白被阻隔在外；在肌萎缩性脊髓侧索硬化症中，分离成液滴的蛋白质会逐渐凝结、变硬，形成有害的固体物质。

关于相分离的检测手段，比较成熟的有以下几种：GFP标记；荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery after Photobleaching，FRAP）；活细胞成像；体外重构相分离结构。

Article

此论文从p62在体内形成液滴的现象出发，揭示了多聚泛素化链可以诱导p62相分离，从而使自噬底物聚集和隔离的现象。

作者先在NRK细胞中表达GFP-p62和Lamp1-mCherry，观察到无膜的p62小体和被自噬体/自噬溶酶体吞噬的p62（Fig. 1a）。接着他们在Atg12^−/−细胞中表达GFP-p62，发现p62小体呈球状并且可以进行融合（Fig. 1b-g）。荧光漂白恢复（FRAP）实验结果表明p62小体在漂白后荧光信号逐渐恢复（Fig. 1h）。这种较慢的恢复速率提示着p62小体有类似液体的性质，且这种液体较粘稠。这些数据表明p62小体可能是通过相分离产生的粘性液滴。

Ube2V2：泛素E2变体（UEV），也称为MMS2或UEV-2；

Ube2N：（与酵母Ubc13同源）是E2缀合酶，与UBE2V2形成异二聚体复合物；

接下来作者想探究p62在体外是否可以发生相分离，结果发现在即使含有120 μM重组mCherry-p62 蛋白的溶液中，p62也没有相分离现象（Fig. 2a, b）。因此作者推测p62的相分离可能需要胞质溶胶的成分。由于p62可以通过其UBA结构域与多聚泛素化链结合（p62小体包含K63多聚泛素化链），并且多价的相互作用能够促进相分离的发生，所以作者推测多聚泛素化链与p62之间的多价相互作用可能促进p62的相分离。为了验证这个想法，作者利用体外泛素偶联体系生成了K63多聚泛素化链（Fig. 2c, d），并将重组mCherry-p62蛋白与K63多聚泛素化链混合，发现混合后能观察到相分离现象，而不加ATP（即不能形成多聚泛素化链）则无相分离现象（Fig. 2e）。以上结果说明K63多聚泛素化链而不是单泛素或其他反应组分可以诱导p62发生相分离。

为了确定p62微滴中是否存在多聚泛素化链，作者通过离心将p62微滴与上清液分离（Fig.2f），发现高分子量泛素信号在p62微滴中富集（Fig. 2g）。融合（Fig. 2h）和光漂白后荧光信号的恢复（Fig. 2i）表明这些微滴为液滴。

作者进一步探究了生理水平的多聚泛素化蛋白能否导致p62相分离。作者利用CRISPR/ Cas9构建p62^−/−的NRK细胞系（Fig. 2j），分离出其细胞溶胶的S150部分，将其与重组mCherry-p62混合；对照用去泛素酶UPS5处理以去除多泛素链（Fig. 2k），结果发现重组p62与细胞溶胶混合后能形成液滴，而与UPS5处理过的细胞溶胶混合后则不能（Fig. 2l）。同样，作者观察到p62液滴中富集了更高分子量的泛素信号，这表明多聚泛素化蛋白可以聚集到p62液滴中，并且p62液滴中存在K63和K48多泛素化蛋白（Fig. 2m）。

这些数据表明，多聚泛素化链对于促进p62的相分离是必要的，在此过程中多聚泛素化蛋白会进入p62液滴。

接下来，作者研究了p62的相分离是否依赖于多聚泛素化链的价态。他们生成了6个或8个泛素分子的线性泛素链（Ubx6和Ubx8，Fig. 3a），发现尽管Ubx8和Ubx6都能导致p62相分离，但Ubx8在较低浓度下就可以诱导p62相分离；且在p62和Ub浓度均固定的情况下，Ubx8对p62相分离的诱导作用强于Ubx6（Fig. 3b, c）。

为了可视化p62相分离过程中多聚泛素化链的掺入，作者构建了GFP-Ubx8（Fig. 3d），并发现它能掺入液滴中（Fig. 3e）。FRAP实验表明，GFP-Ubx8信号的恢复速度远快于p62信号（Fig. 3f）。不同的恢复速度意味着p62和GFP-Ubx8分别扩散且不能形成稳定的分子复合物。

LC3可以直接与p62结合，且p62与LC3的相互作用被认为是连接含p62的蛋白聚集物与自噬体的机制。作者发现在Atg12−/−细胞中，LC3与p62有共定位，这表明未偶联的LC3可以被招募到p62小体内（Fig. 4a）。FRAP实验发现，LC3的恢复速度远快于p62，这说明LC3- I在p62小体内的扩散速度相当快（Fig. 4b）。

接着作者发现在体外GFP-LC3被包裹在p62液滴中（Fig. 4c），且在FRAP实验中GFP-LC3比p62信号恢复快得多（Fig. 4d）。这些数据表明未偶联的LC3在体内和体外都能被招募到p62小体中。

p62有一个N端PB1结构域（通过PB1结构域被组织成柔性聚合物）和一个C端泛素相关（UBA）结构域（通过UBA结构域与泛素结合）（Fig. 5a）。作者发现p62多聚化所必需的PB1结构域和泛素结合所必需的UBA结构域中的M404对于p62小体在体内的形成和自噬降解是必需的（Fig. 5b-e）。进一步的研究发现mCherry-p62-M404V和mCherry-p62-ΔPB1明显削弱了多聚泛素化链诱导的p62相分离。这些数据表明p62的聚合以及多聚泛素化链与p62的相互作用在p62相分离中起着至关重要的作用。

p62具有多种翻译后修饰，其中通过酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化S403可以增加UBA和多泛素链之间的相互作用。为了探究p62的翻译后修饰是否会影响多聚泛素化链诱导的p62小体形成和p62相分离，作者在ATG12^−/−细胞中表达p62-S403E以模仿S403磷酸化，发现其p62小体的数量略高于野生型（Fig. 6a, b）。且p62-S403E形成的p62小体明显大于野生型（Fig. 6a, c），并且p62-S403E的自噬降解能力也增强（Fig. 6d, e）。这些数据表明S403磷酸化可促进p62小体形成和自噬降解。同样，表达mCherry-p62- S403E的细胞中多聚泛素化链诱导的p62相分离也增强（Fig. 6f）。这些结果表明，p62的相分离可以通过磷酸化修饰进行调节。

Paget’s disease of bone (PDB)：佩吉特骨病

p62突变已被确定为佩吉特氏骨病（Paget’s disease of bone, PDB）的病因，到目前为止，在PDB中发现的所有突变都位于p62的UBA结构域。M404V与PDB相关的事实促使作者研究PDB突变是否影响p62的相分离。作者构建了带有两种PDB突变的p62-GFP，M404T和G411S，然后检测了突变蛋白在p62^−/−细胞中形成p62小体和经历饥饿诱导降解的能力。结果发现这两种突变都影响p62小体的形成和p62的自噬降解（Fig. 7a-d）。此外，多聚泛素化链诱导的p62相分离现象因这些突变而明显减弱（Fig. 7e）。

综上，文章作者提出一个自噬底物通过多聚泛素化链诱导p62发生相分离的模型。在这个模型中，多聚泛素化链不仅是一个使受标记蛋白质自噬降解的标签，而且还充当一个激活信号来触发底物隔离。

文字：阳星月，罗茂超

图片：阳星月，罗茂超

编辑：贾文慧

校正：金萍

终审：周立