2021.1.5 罗茂超分享“在高渗诱导细胞体积变化时，多价的蛋白质快速、可逆的相变现象”的故事
BACKGROUND
图片引自：https://www.nyas.org 相分离是一个经典的物理化学概念，二元或多元混合物重新排列，在一定的空间区域各成一相。相分离现象无处不在，从水上漂油花的宏观相分离到高分子嵌段共聚物材料的微观相分离，当然此刻，在我们的身体细胞中，相分离现象也无时无刻不在发生着。 为了实现特定的功能，细胞进化出了一系列的细胞器，包括有膜包裹的（如线粒体，细胞核等）和无膜包裹的（如核仁，应激颗粒 （stress granules , SGs） 等）。有膜细胞器会将特定蛋白、核酸等物质包裹在膜内，以确保他们在指定的空间内执行其功能。另一类更有趣的是无膜细胞器，在没有膜的束缚下，细胞器依然可以稳定存在，并与周围环境发生频繁的物质交换。 Hyman和Brangwynne 2009年在Science发表了题为：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章 (Brangwynne et al., 2009)，文中提出生物大分子在胞质溶胶中并不是完全均一的分布，它们在细胞内可以通过“相分离”，可以提供一种特定的方式让细胞内的特定分子聚集起来，以实现其功能的区块化。
细胞内的相分离结构 (Brangwynne et al., 2009) 无膜凝聚体，通常被称为无膜细胞器(MLOs)，它们实质上是哺乳动物细胞胞浆或细胞核中，与核基质和细胞质基质相比，转录、翻译、转录后基因调控和代谢等活动呈现出明显区域性变化的一些亚细胞位点。MLOs的失调和突变蛋白的异常凝聚已被证实与基的因调控的改变和病理过程密切相关。
细胞质加工小体（Cytoplasmic processing bodies）或称P小体（P-bodies, PBs），通过浓缩细胞质中的酶参与mRNA的更新，同时，P小体屏蔽了众多不需要翻译的mRNA链，使它们远离翻译蛋白。2009年，德国马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所Tony Hyman教授发现线虫生殖细胞中的P颗粒（P Granules）具有液滴样性质 (Brangwynne et al., 2009)。事实上，P小体是细胞质中不连续的区域，其中存在很多参与转录后过程的细胞因子，例如参与mRNA的降解、翻译的抑制、mRNA的监控和RNA干涉等过程的细胞因子都可能在P小体中出现。而这种无膜细胞器P小体的形成，正是相分离过程介导的。 ARTICLE Graphical Abstract
本文从细胞在高渗应激时胞内蛋白特性的改变入手。揭示了高渗应激导致细胞体积的变化，从而导致分子拥挤的内部状态，进而促使一些多聚体蛋白通过快速和可逆的相分离对这种细胞变化作出快速反应。 Figure 1. Extent and Kinetics of DCP1A Phase Separation during Hypertonic Stress Are Distinct from Those of the SG Marker G3BP
先前研究发现，渗透胁迫导致DCP1A的相分离,DCP1A是PB的一个标志性组分。为了更广泛地研究PB在应激反应中形成的细胞内动力学，我们对U2OS细胞用高渗应激源(Na离子)和氧化应激源（SA）处理，并在处理前后用免疫荧光(IF)和RNA荧光原位杂交(FISH)对细胞进行测定。结果表明，与已知的应激颗粒（SG）标志性蛋白G3BP在氧化应激条件下的不可逆相分离不同。细胞外渗透压的变化可以导致PB的标志蛋白DCP1A的快速的细胞内相分离，而在应激源消失后，DCP1A的相分离现象也随之消失。也就是说，高渗胁迫可以诱导DCP1A的可逆相分离。
Figure 2. Physicochemical and Phenotypic Characterization of DCP1A Phase Separation during Hypertonic Stress
为验证高渗胁迫的几组条件是不是通过对细胞活力的影响引起一系列的反应，作者用不同浓度的溶液对细胞进行处理，发现细胞活力并没有受到很显著的影响，故否定了这一假设。为了更直观地观察DCP1A的相分离过程，作者构建了稳转GFP-DCP1A的U2OS细胞系，将其命名为UGD。通过GFP发出的绿色荧光，作者观察到随着Na+浓度的提升，DCP1A的相分离现象越来越明显，且随着渗透压的增加，相分离液滴的运动也有所减慢。为探究DCP1A的相分离现象是否与造成高渗的离子种类有关，作者还用Ca2+、Mg2+代替了Na+进行高渗胁迫实验，结果现实Ca2+、Mg2+导致的高渗胁迫同样能引起DCP1A的相分离，这说明高渗胁迫介导的DCP1A的相分离与离子种类无关。 Figure 3. Hyperosmotic Compression Mediates DCP1A Phase Separation
接下来，为探究非离子条件造成的高渗胁迫能否引起DCP1A的相分离，作者使用山梨糖醇代替Na+对细胞进行高渗处理，发现DCP1A发生相分离的条件不依赖于离子，而仅取决于渗透压。通过对细胞进行3D拍摄，作者证实了高渗处理会使细胞的体积缩小。为进一步确认DCP1A相分离的可逆性，作者对UGD细胞进行了循环渗透压处理，经历多个循环后，DCP1A的相分离依然可逆，这进一步验证了高渗处理诱导的DCP1A相变是一个可逆过程。 Figure 4. HOPS of DCP1A Is Dependent on Its Trimerization Domain and Modulated by PTMs but Not Its Interaction with EDC4
大分子相分离被广泛认为是由特定侧链相互作用和结构介导的多价蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用驱动的。为了研究DCP1A相变的分子基础，我们首先测试了高渗诱导的相分离对不同DCP1A结构域的依赖性。DCP1A包含两个的蛋白质相互作用结构域，一个是位于N端的能与mRNA分解蛋白DCP2相互作用的EVH1结构域，一个是位于C端的能与EDC3/4相互作用三聚结构域。为探究这两个结构域对DCP1A相变的作用，作者将DCP1A的N端结构域(NTD)或C端结构域(CTD)的截短突变蛋白用GFP标记之后，瞬时转染U2OS细胞。当用高渗对细胞进行处理后，作者发现观察到CTD表现出与全长蛋白相似的快速和可逆的相变现象。但当作者对与CTD相互作用的EDC4进行敲降后，DCP1A的相变过程并没有受到显著影响，这说明DCP1A的相变过程与CTD有关，但并不依赖于CTD区与EDC4的互作。 以前的报道表明PB的形成可以通过翻译后修饰(PTM)来调节，为进一步探明PTM介导的DCP1A相分离的分子机制，作者用磷酸酶抑制剂(PI)与N端激酶抑制剂(KI)干预UGD细胞中的翻译后修饰过程，结果表明，PI处理后DCP1A相分离后运动变慢，KI处理后促进DCP1A的相分离。以上结果表明，DCP1A的相分离依赖于其三聚体结构域，并受到PTMs的调节。 Figure 5. High-Throughput IF and GFP Imaging Show that Several Multimeric Proteins of a Valency of 2 or More Generally Exhibit HOPS
考虑到DCP1A的HOPS现象的最小所需结构决定因素只是它的三聚化结构域，作者推断其他具有多聚化结构域的自相互作用蛋白也可能表现出HOPS现象。为此，作者用高通量IF及GFP成像实验筛选出一些可能发生多聚化的蛋白，并从中选取了HSF1,PKM2,PAICS,FUS四种可能发生HOPS的蛋白，用GFP标记-荧光成像的方法证实了它们的HOPS现象。 Figure 6. HOPS of CPSF6 Is Correlated with Impaired Transcription Termination
上文中筛选出可发生HOPS的蛋白中，CPSF6是裂解和多腺苷化特异性因子(CPSFs)的结构成分，它参与了转录本的3’端的转录中止与转录后加工。已有研究表明，高渗胁迫期间CPSFs功能受损与某些细胞系的转录终止缺陷有关。为探究CPSF6的可逆相变在高渗胁迫中的作用，作者通过Bru-Seq实验，CHIP-Seq实验等方法，作者发现，在高渗诱导下，CPSF6的相分离使其被束缚在凝缩相中，进而使CPSF的活性发生抑制，进而抑制转录中止作用，使某些位于TES下游的基因得以表达。 Figure 7. Model of the Multiscale Features of HOPS
综上所述，在这项研究中阐述了高渗介导的细胞内可逆相分离现象（HOPS）的多尺度表征，作者发现，在渗透细胞体积变化过程中，多聚体蛋白质组的很大一部分，通过快速和可逆的细胞内相变过程，再分配到相分离的凝聚体中。同时，数据分析结果表明，还有许多存在自相互作用的三价及更高价态的蛋白质，在细胞体积的变化中表现出HOPS，这些变化与高渗胁迫期间水化和分子拥挤的改变密切相关。 高渗介导的细胞内相分离现象只是相分离现象在保护性细胞机制中作用的冰山一角，希望未来的研究可以对相分离现象以及无膜细胞器与保护性细胞机制间的互作机制进行更全面、系统的阐明，帮助我们更好地理解相分离现象细胞生命活动中的作用机制。 文字：房勇廷，罗茂超 图片：房勇廷，罗茂超 编辑：贾文慧 校正：金萍 终审：周立
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