2020.12.31 李博闻分享 “过度激活的NRF2通过调控细胞增殖和铁死亡来调控类器官的形成”的故事
背景1. ROS与肿瘤发生发展。细胞中存在氧化还原平衡，细胞中的线粒体、内质网等可以产生ROS，而细胞中的抗氧化酶可以还原ROS，维持机体的ROS在正常水平，但是在应激条件下，ROS水平可能会显著高于正常水平，会导致细胞损伤和疾病发生。
背景2. NRF2的抗氧化调控。NRF2是机体抗氧化的重要调控开关，在生理状态下，大多数NRF2与它的泛素化酶KEAP1结合，并被泛素标记降解，但是在氧化应激下，KEAP1构象变化，释放NRF2入核，诱导抗氧化酶的转录。 癌细胞通过改变代谢网络以提供细胞分裂和快速生长所需的稳定能源和中间代谢物。然而，这会导致包括活性氧(ROS)在内的毒性副产物的生成，从而促进氧化应激，损害癌细胞活性。因此，一些肿瘤细胞可以上调细胞中的抗氧化体系，以克服氧化应激的毒性。转录因子NRF2是氧化应激条件下细胞氧化还原动态平衡的主要调节分子。NRF2调控多种抗氧化机制，包括SOD、GSH、GPX等抗氧化酶的合成。NRF2的过度激活是肿瘤发生的原因之一，尤其是在非小细胞肺癌中，有相当比例的肺癌患者都有NRF2、KEAP1的失调，并且NRF2的激活水平与临床预后直接相关。因此，针对NRF2过度激活的分子机制研究对肿瘤患者的治疗具有重要意义。
背景3. 铁死亡。作者之前09年的文献提示3D培养的细胞ROS会上调，并且触发死亡，可能是诱导了铁死亡。铁死亡发生过程中经历经典的芬顿反应，铁离子催化呈亚铁离子和强氧化性的羟基自由基，促使脂质过氧化，最终诱导细胞死亡。细胞可以通过摄取半胱氨酸生成谷胱甘肽，在GPX4的催化下，使GSH还原过氧化脂质，缓解铁死亡的发生。
Figure 1. 3D Spheroids of NRF2-Hyperactivated Lung Cancer Cells Are More Dependent on NRF2 for Survival and Proliferation Compared with 2D Monolayer Cells.
作者首先验证在2D和3D模型中敲低NRF2，发现3D模型的细胞数量发生的显著的减少，而2D的没有这么显著，说明2D和3D的模型对NRF2敲低的敏感性不同。对于早期的细胞团（第8天）进行NRF2敲低影响细胞团块的大小，说明NRF2调控细胞团的生长。而在细胞团生长的维持期（第12天），NRF2基因敲低诱导A549球体内未与细胞外基质结合的细胞死亡，说明NRF2对细胞团块中心细胞的生存有显著影响。为了防止脱靶效应，作者回补了与所用sh序列无法结合的同义突变的NRF2质粒，发现生长与生存都能得到回复。做到这里，作者基本明确了NRF2对于细胞团块的生长和生存都有重要作用，并且表型完全不同于2D的细胞。作者接下来就想看看这个表型的差异会不会有临床意义。 Figure 2. High NRF2 Activity Is Required for Efficient Lung Cancer Spheroid Formation.
于是作者综合了非小细胞肺癌的腺癌、鳞癌、头颈癌、子宫颈癌的患者的数据，为样本中NRF2相关突变及下游基因激活情况进行评估，统计NRF2系数，发现在非小细胞肺癌细胞系中，NRF2系数与细胞团块的大小呈线性相关。并且敲低KEAP1也会对表型产生显著影响，说明NRF2的活性越高，细胞团块的生长和生存就越强。 Figure 3. Antioxidants Rescue Survival but Not Proliferation Defects Caused by NRF2 Downregulation. 考虑到NRF2调节细胞抗氧化还原体系，作者研究了2D和3D培养条件下的细胞氧化还原状态。研究结果发现3D培养相对于2D培养，ROS水平增强，GSH/GSH二硫键(GSSG)水平降低，表明与单层细胞相比，球形细胞团块受到更多的氧化应激。接下来，作者研究了抗氧化处理是否可以挽救NRF2敲低诱导的内球形细胞清除和减少增殖。通过抗氧化剂nacetyl半胱氨酸(NAC)或谷胱甘肽乙酯(GSH- ee)(谷胱甘肽的一种膜透性衍生物)处理，NRF2敲低后A549和H1437细胞在腔内空间的存活显著增加，但是对于NRF2敲低导致的生长抑制却不能回复。到这里，研究结果提示ROS可能是NRF2敲低导致内部细胞死亡的关键因素，但是增殖的因素还有其他的因素。因此，作者需要进一步确定NRF2影响表型的具体效应分子。
Figure 4. CRISPR-Cas9 Screens in 2D versus 3D Cultures Reveal Dependencies of Spheroid Growth in NRF2- Hyperactivated Cancer Cells.
通过在TCGA中比较四种肿瘤中因NFE2L2和KEAP1突变导致的NRF2激活的细胞，与野生型的基因表达进行比较，筛选基因，然后在筛选的基因中结合非小细胞肺癌中NRF2，KEAP1共表达的基因，并引入sg数据库，最终筛选到1500个基因。鉴于NRF2敲低在2 D细胞生长的影响都不像3 D球体增长迅速，作者在2D和3D培养条件下，同时在A549和H1437细胞中进行聚合CRISPR-Cas9筛选在3D和2D培养下，表达差异较大的分子，发现TSC1和GPX4分别是正相关和负相关最明显的分子。 Figure 5. Loss of TSC1 and GPX4 Enhances Proliferation and Inner Clearance, Respectively, in Spheroids.
TSC1是mTOR通路的重要调控分子，而NRF系数与mTOR抑制剂的IC50呈线性关系，敲低TSC1可以促进细胞团块生长，但是敲低NRF2后没有显著变化，而且抑制mTOR之后也没有显著变化，说明TSC1的促生长是通过mTOR完成的。在3D培养中，只有当NRF2信号通路完好无损时，mTOR信号通路的激活可增强增殖。 Figure 6. NRF2 Regulates Survival of Inner Matrix Deprived Cells through Protection from Ferroptosis.
在A549、H1437和H520细胞中，使用GPX4抑制剂ML210或RSL3处理的球状体形成后，其腔内细胞存活率下降。为了确定与NRF2敲低相关的球状体内部清除是否由铁死亡介导，作者在Fer-1存在的情况下培养了A549和H1437球状体。Fer-1处理通过抑制NRF2的表达阻止了球状体的内部清除，表明NRF2通过调控铁死亡来维持内部细胞的生存。
值得注意的是，比率型脂质过氧化探针c11-bodipy实验表明，NRF2的敲低以及GPX4抑制剂ML210的处理显著增加了球状体核心的脂质过氧化物水平，表明细胞团内部细胞易发生脂质过氧化，NRF2可调节细胞团块脂质过氧化。Fe2+可以通过Fenton反应产生羟基自由基，促进铁死亡，但实验表明NRF2敲低并没有增加细胞内的Fe2+水平；促进脂质过氧化的上游分子ACSL4的表达也没有明显变化。表明NRF2下调的细胞对铁死亡的敏感性增加并非由于Fe2+或ACSL4的变化。
实验证明NRF2敲低诱导GPX4的高表达。作者一开始假设NRF2下调引起的氧化应激增强可以激活其他细胞保护程序，如核因子kB (NF-kB)，从而上调抗氧化酶的转录。而进一步的实验证明NRF2的下调不会诱导GPX4 mRNA的表达，而且氧化应激的增强并不足以稳定GPX4蛋白。
GPX4是一种含硒蛋白，含有硒半胱氨酸(Sec)，第21个氨基酸。因此，在NRF2下调后诱导GPX4蛋白可能是硒蛋白翻译的改变。NRF2下调后的GPX4蛋白可能是硒蛋白翻译的变化。作者通过液质联用检测到的大多数硒蛋白在NRF2下调后表达增加.
Figure 7 Targeting NRF2 and GPX4 Leads to Substantial Cell Death in Lung Cancer Spheroids.
考虑到GPX4对细胞氧化应激的保护角色，作者接下来探究靶向NRF2与GPX4的联用对非小细胞肺癌的治疗效果。发现同时靶向NRF2和GPX4能显著杀伤3D培养的肿瘤细胞团，并且可以观察到细胞团的内部和外部的脂质过氧化都明显升高，增强了对非小细胞肺癌的杀伤力，具有较好的临床应用前景。 Summary 总的来说，作者利用3D癌症球状模型与CRISPR-Cas9筛选，证明NRF2过度激活可调节增殖，防止铁死亡、脂质过氧化诱导的非凋亡性细胞死亡，是肿瘤实体形成的必要条件。NRF2的缺失可使大部分硒蛋白（包括脂质过氧化物酶GPX4）上调，靶向NRF2和GPX4则可以杀伤整个肿瘤球体的细胞 文字：李博闻 图片：李博闻 编辑：明慧 校正：金萍 终审：周立
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