2021.07.14 李博闻分享“表观遗传沉默通过抑制FBXL7表达，导致c-SRC积累并促进肿瘤发生发展”的故事
本文作者是来自于纽约大学的Pagano教授，他长期从事细胞周期及泛素化降解相关研究。
背景1. 表观遗传与肿瘤发生发展。肿瘤在发生发展过程中伴随着基因转录的调控，其中表观遗传（如组蛋白修饰、DNA甲基化、非编码RNA等）在肿瘤的转移过程中扮演关键角色。
背景2. DNA甲基化。DNA甲基化是最常见的DNA的表观遗传修饰，在哺乳动物中发生在胞嘧啶的5位碳原子上，CpG岛中胞嘧啶的甲基化导致启动子区域不能与转录因子结合，抑制基因表达。胚胎在发育的过程中伴随着多个通路开关的精密调控，到成年后，大多数的基因启动子区域被甲基化沉默。而表观遗传调控的失调往往伴随着抑癌基因的异常沉默和促癌基因的异常激活。
背景3. F-Box家族介导泛素化降解。作者长期从事泛素化降解的研究，因此也将研究重心放在泛素化降解上。泛素化降解过程中的核心复合物是SCF复合物（SKP1、Cullin1和F-Box家族），与泛素化底物结合后，在调节亚基的协助下泛素化底物，并带去蛋白酶体降解。其中F-Box家族蛋白因为被发现可以降解Cyclin F而得名，该家族蛋白都具有F-Box底物识别基序，在多种生理活动中发挥关键调控功能。SKP1: S-phase kinase-associated protein 1；CAND1: Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1；NEDD8: Ubiquitin-like protein；RBX: RING-box protein, E3 ligase；CSN5: Signalosome complex subunit 5。
Figure 1. FBXL7 is silenced by promoter hypermethylation in advanced human cancers
作者首先在多个数据库中筛选85个F-Box家族启动子DNA甲基化水平，发现FBXL7的甲基化水平最高。在恶性肿瘤，尤其是恶性程度较高的胰腺癌肿瘤细胞中验证，发现相较于永生化细胞H6c7，FBXL7在其他胰腺癌细胞中低表达。亚硫酸氢钠处理后，未被甲基化的胞嘧啶会发生脱氨基反应成为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不会脱氨基，可通过特异性引物进行PCR验证甲基化水平，发现在肿瘤细胞中FBXL7的甲基化水平明显上升。
作者在发展较为缓慢的前列腺癌细胞中也验证了FBXL7的表达下调表型。在肿瘤发展程度依次加重的PC-3、PC3M和PC-3M-LN4细胞系中，FBXL7也逐渐减少，甲基化水平逐渐增加，验证了肿瘤发展过程中FBXL7甲基化沉默的现象。作者使用FDA批准的去DNA甲基化的抗肿瘤药地西他滨处理肿瘤细胞，发现可以回复FBXL7的表达。
接下来，作者在不同阶段的肿瘤患者样本中也验证了FBXL7的表观沉默与肿瘤发展的相关性。FBXL7的甲基化沉默及蛋白水平与胰腺癌、前列腺癌患者预后密切相关。敲低 FBXL7 增强了肿瘤细胞的侵袭能力，通过去甲基化药物处理后一定程度上抑制了肿瘤细胞的侵袭能力，提示靶向FBXL7 的临床应用前景。 Figure 2. High NRF2 Activity Is Required for Efficient Lung Cancer Spheroid Formation.
由于FBXL7是参与泛素化降解的关键蛋白家族F-Box的成员，作者接下来拟探究FBXL7的底物。通过相互作用蛋白组筛选，作者注意到了c-SRC这一个显著的促癌的酪氨酸激酶。作者通过IP验证发现c-SRC只与F-Box家族中的FBXL7相互作用，进一步发现FBXL7只与活化的c-SRC（p-c-SRC Y419）相互作用，而非活化的c-SRC（p-c-SRC Y530）则没有相互作用。加入蛋白酶抑制剂MG132后，可以回复FBXL7对活化c-SRC的降解，转入赖氨酸突变的泛素后，c-SRC迁移条带消失，提示FBXL7可以泛素化c-SRC。相对于之前文献报道的c-SRC泛素化降解关键分子CBL，敲除FBXL7能明显逆转加入CHX之后c-SRC的降解，提示FBXL7通过泛素蛋白酶体途径降解c-SRC。
接下来，作者采用截短突变探究相互作用位点，发现截短SH3后，c-SRC无法与FBXL7相互作用，进一步发现相互作用位点在101-116位。作者进一步发现c-SRC上存在S104这一个保守位点，且该位点的磷酸化是与FBXL7结合的重要前提。加入磷酸化抑制剂、进行持续磷酸化和去磷酸化突变均可影响FBXL7和c-SRC的相互作用。 Figure 3. Defects in the FBXL7-mediated degradation of c-SRC increase cell migration, invasion and the expression of EMT markers
在明确两个分子的相互作用之后，作者拟进一步探究这两个分子的生物学功能。回补c-SRC对细胞增殖没有明显影响，但可提高肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，回补S104A、S104F突变的c-SRC可进一步提高迁移、侵袭能力。
敲低FBXL7可显著提高间质样Marker的升高和细胞迁移、侵袭能力。敲低FBXL7后，进一步敲低SRC，可以回复EMT和细胞迁移、侵袭的表型；过表达FBXL7可以抑制肿瘤细胞迁移、侵袭。 Figure 4. FBXL7 is downregulated and c-SRC is up-regulated in highly aggressive human pancreatic and prostate cancers
作者接下来探究FBXL7和c-SRC相互作用的病理学意义。FBXL7蛋白水平在肿瘤细胞和恶性程度高的肿瘤细胞中低表达，c-SRC则高表达。我们发现FBXL7无法降解c-SRC（S104A），并且地西他滨的作用也依赖于c-SRC与FBXL7的相互作用。 Figure 5 Human cancers show mutations in FBXL7 and SRC, resulting in the stabilization of c-SRC
作者也关注了胰腺癌和前列腺癌患者中常见的FBXL7和c-SRC的突变，发现FBXL7 (R310H)、FBXL7(P65S)、FBXL7(P93L)等突变型减少了FBXL7和c-SRC的相互作用，导致了患者较差的预后。FBXL7(Q271H)、FBXL7(R353Q)、FBXL7(T458M)、FBXL7(R480H)、FBXL7(R480C)、FBXL7(Y145*)等突变型不影响FBXL7与c-SRC的相互作用，但是影响了FBXL7与Cullin1或SKP1的结合，也影响了c-SRC的降解。c-SRC(S104F)、c-SRC(N116D)、, c-SRC(R110Q)、c-SRC(T117I)的突变也影响了其与FBXL7的相互作用，这些位点都具有临床意义，可作为潜在的诊疗标志物。 Figure 6: Loss of FBXL7 promotes c-SRC-dependent metastases in mouse models of prostate and pancreatic cancers
作者接下来在动物模型进行进一步验证。发现FBXL7过表达抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，回补SRC后肿瘤无明显变化。地西他滨处理可以抑制前列腺癌生长，回复FBXL7敲低造成的肿瘤进展。
作者进一步运用胰腺癌构建脾注射肝转移模型，发现FBXL7敲除促进胰腺癌进展，c-SRC抑制剂达沙替尼可在一定程度上抑制胰腺癌进展。同时，使用地西他滨也可以有效抑制胰腺癌细胞的转移和进展。
总的来说，c-SRC是促癌的酪氨酸激酶，可通过S104磷酸化经FBXL7依赖的泛素蛋白酶体途径降解。在肿瘤发展过程中FBXL7的启动子区域被甲基化，使FBXL7表达下调，c-SRC在细胞中积累，促进肿瘤发生发展。FBXL7的表观沉默及其与c-SRC的相互作用可作为胰腺癌和前列腺癌的潜在药物靶点或诊疗标志物。
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