2021.07.16 曹蒋军分享“利用CRISPR文库筛选和3D培养模型证明NRF2在细胞球体形成及铁死亡过程中的重要调控作用”的故事
代谢重编程是肿瘤发生发展中面对氧化应激常见的方式之一。NRF2作为一种抗氧化转录因子，在多种肿瘤中显著激活。作者利用3D细胞培养模型，在更加接近体内肿瘤生长的条件下，对NRF2的功能进行进一步的探索。 1. 在肺癌细胞中，3D细胞的生存和增殖比2D细胞更依赖于NRF2的过度激活 为了验证NRF2过度激活与细胞生存增殖的关系，作者选取了NRF2异常激活占例最高的肺癌。并挑选了NRF2高表达的A549和H1437非小细胞肺肿瘤细胞株进行下面试验。通过实验结果我们发现，NRF2的敲降能够显著地影响细胞的生长能力，并且在3D培养的细胞中更为显著。与此同时，NRF2的敲降能够明显抑制细胞球体内部细胞的生存能力。利用NRF2回补实验，进一步验证了NRF2对细胞球体增殖和其内部细胞生存的重要作用。
2. 肺癌细胞球状体的有效形成依赖于NRF2的高度活化。 为了进一步评估NRF2对球形生长的影响，作者在大量肺癌细胞系中检测了NRF2激活状态与球形生长之间的关系。为了获得NRF2基因“标签”，作者在癌症基因组图谱(TCGA)项目中挖掘了主要患者数据。作者发现了1466个在NRF2通路中NRF2过活化基因改变(NFE2L2突变/扩增或KEAP1或CUL3突变/缺失)的肿瘤中显著高于或低于NRF2通路中NRF2过活化基因改变的肿瘤中的基因，获得了一个55基因的NRF2“标签”。此外，作者发现至少在肺癌细胞系中，NRF2的高活性是高效球形形成的必要条件。为了进一步研究NRF2过活化对球状体形成的影响，作者研究了通过crispr -cas9介导的KEAP1敲除强制稳定NRF2是否可以提高NRF2通路中没有遗传改变、表现出低或中等NRF2分数的肺癌细胞系的球状大小和内部细胞的存活。KEAP1敲除增加了两种细胞系中球形细胞的大小，增加了NRF2蛋白的表达和活性，并减轻了H596细胞中内球形细胞的死亡。这些数据提供了额外的证据，表明高NRF2活性可以促进肺癌细胞中有效的球形形成。LUSC和LUAD原发患者肿瘤的NRF2评分与增殖特征评分呈正相关，支持NRF2活性和人类肿瘤增殖之间的潜在联系。在一组肺癌细胞系中，NRF2评分与2D细胞生长没有相关性，表明NRF2的过度激活并不能解释肺癌细胞系中2D增殖的差异。
3. 抗氧化治疗可回复球状体中NRF2下调引起的增殖损失，但不能促进内部细胞的存活。 为了验证NRF2对细胞球体增殖和内部细胞生存的调控作用是否是由NRF2的抗氧化作用所介导的，作者首先检测了3D与2D培养条件下，细胞氧化应激水平。通过结果发现3D培养下细胞内部ROS水平显著高于2D培养的细胞。随后作者通过加入抗氧化物N-乙酰半胱氨酸(NAC)或谷胱甘肽乙酯(GSH-ee)(谷胱甘肽的一种膜透性衍生物)，以缓解NRF2缺失所导致的细胞内部ROS水平的上调。通过实验结果发现，抗氧化物的加入能够显著的回复NRF2缺失所导致的内部细胞生存能力降低，但是对于细胞的增殖能力的减弱并没有显著地改善。提示作者，NRF2对于肺癌细胞球体增殖和生存能力是通过不同的途径所介导的。 4. 用CRISPR文库筛选鉴定NRF2过活化细胞与球体形成的关系。 为了识别介导NRF2过活化诱导球状体生长的关键基因和/或程序，并定义NRF2过活化肿瘤的候选依赖关系，作者在A549和H1437细胞中进行了汇总CRISPR-Cas9筛选。通过去除在肺肿瘤或KEAP1/CUL3/NFE2L2改变的细胞系中低水平表达的基因，以及与NFE2L2共扩增或与KEAP1/CUL3共删除的基因，该列表得到了削弱。考虑到NRF2敲降对2D细胞生长的影响不如对3D球体生长的影响显著，作者的筛选方法是在2D和3D培养条件下，同时在A549和H1437细胞中进行聚合CRISPR-Cas9筛选，以识别重要的基因，特别是对球形生长的基因。通过筛选结果发现与2D培养条件相比，在3D培养条件下两种细胞系中靶向TSC1的sgRNAs的富集和靶向GPX4的sgRNAs的减少。 5. NER2能够通过抑制肺癌细胞铁死亡促进内部细胞的生存能力。 作者通过加入GPX4抑制剂ML210发现GPX4的抑制会导致细胞球体内部细胞的生存能力显著的下降。鉴于GPX4是细胞铁死亡的关键调控蛋白于是作者加入铁死亡抑制剂检测其对于细胞球体内部细胞生存能力的改变。通过结果发现，铁死亡抑制剂能够显著回复GPX4缺失或者NRF2缺失所带来的细胞球体内部细胞生存能力的减弱。但是铁死亡抑制剂不能改变NRF2缺失所介导的增殖能力降低。于此同时，NRF2的敲降能够显著增强癌细胞球体内部脂质过氧化水平。铁死亡的发生除了能够被GPX4的缺失所诱导，还可能是由于二价铁离子或ACSL4水平的增加所引起，因此为了探究其中的关键原因，作者检测了二价铁离子和ACSL4水平，结果发现NRF2的敲降不能引起上述两者的高表达。
6. NRF2的下调诱导包括GPX4等硒蛋白表达上调。 为了进一步验证GPX4与NRF2的调控关系，作者检测了NRF2敲降后GPX4的表达水平。通过结果发现，NRF2的敲降能够显著上调GPX4的表达水平。GPX4作为硒蛋白的一员，NRF2的缺失是否只能特定增加GPX2的表达呢？带着这个疑问作者采用等压串联质谱标记结合液相色谱-串联质谱分析。结果表明NRF2敲除后GPX4对该硒蛋白的诱导不是特异性的;相反，大多数硒蛋白受到硒蛋白生物合成的全局调节的影响。其关键原因是因为TXNRD1是NRF2的靶向调控蛋白，NRF2的缺失会显著影响其表达从而增加了硒的含量，因此利用率是GPX4表达的关键因素。硒补充并不诱导TXNRD1的表达。
7. NRF2的缺失和GPX4的抑制共同导致球状体内外细胞的死亡。 接下来，作者研究了NRF2的减少和GPX4活性的抑制是否在3D培养中具有特异性的致死性，或者这种组合是否对2D培养条件下的细胞也具有致死性。在2D培养条件下，即使不进行基因操作，A549细胞也对ML210敏感，而H1437、H520和sk - mps-1细胞的敏感性较低或不敏感，NRF2下调使A549、H1437、H520和sk - mps-1细胞对ML210轻微致敏。在3D培养中，shNRF2的诱导使细胞对ML210更加敏感。在2D和3D培养条件下，与Fer-1共同处理完全恢复了ML210的敏感性。沉默NRF2使球状细胞在GPX4表达上调的情况下，仍然对铁死亡高度敏感。接下来，作者评估NRF2和GPX4联合缺失是否会加剧脂质过氧化从而加剧细胞死亡。结果发现在ML210的NRF2敲除球形体的外部区域观察到的脂质过氧化水平可能高于脂质过氧化导致的铁死亡的阈值水平。因此，多重氧化应激防御程序的联合靶向是有效杀伤肿瘤细胞的必要条件。
综上所述，作者发现在3D培养过程中，NRF2能够通过增加mTOR的活性从而促进肺癌细胞球体的增殖能力，并且随着细胞球体内部ROS水平增高，NRF2能够发挥其抗氧化能力抑制细胞球体内部细胞脂质过氧化水平从而抑制铁死亡的发生，增强细胞的生存能力。与此同时，作者还发现NRF2能够抑制含GPX4在内的硒蛋白的表达，而GPX4的表达也对癌细胞球体内部细胞的铁死亡有上述类似的抑制作用。
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