肿瘤细胞基因组的高度不稳定性为肿瘤发展提供了必要的变异来源，而体细胞拷贝数改变（SCNAs）影响了肿瘤细胞中超过30%的基因组[1-3]。基因组的扩增与多种实体瘤的不良预后密切相关，对于HCC而言，Chr1q21发生扩增的患者往往倾向于更短的生存期[4]。已有的研究发现Chr1q21中存在多个驱动肿瘤进展的癌基因，如CHD1L、BCL9等[5, 6]。但鉴定存在于Chr1q21中具有调控作用的Antisense LncRNA的研究仍然匮乏。
1. LINC00624是HCC潜在的促癌反义lncRNA
在本研究中，作者分析了TCGA数据库中373例肝癌患者的SCNAs，在基因组全外显子中共筛选出225个显著扩增峰和251个缺失峰，而Chr1q21中共有6个扩增峰，其中4个扩增峰与HCC的不良预后密切相关。在这4个扩增峰中共筛选出3条Antisense LncRNA，而仅有LINC00624在作者所建立的两个临床样本队列的肿瘤组织中相对高表达。LINC00642位于癌基因CHD1L和BCL9的反义链上（Chr1q21.1），在肝癌中发生显著的拷贝数扩增且RNA水平显著升高，与HCC的不良预后密切相关。
2. LINC00624促进HCC细胞增殖以及侵袭、迁移
利用体外细胞模型及多种动物模型（包括肝内转移模型、尾静脉注射肺转移模型、脾注射肝转移模型以及皮下瘤模型），明确了LINC00624作为促癌Antisense LncRNA参与HCC的发生发展过程。
3. LINC00624通过正向调控CHD1L和BCL9B表达促进肝癌进展。
由于LINC00624在基因组中位于CHD1L和BCL9 反义链，LINC00624可能通过调控这两个癌基因的表达，从而影响肝癌的发生发展。作者通过干预LINC00624表达后检测CHD1L和BCL9的mRNA及蛋白水平，发现LINC00624可正向调控CHD1L和BCL9两个癌基因的表达，随后在LINC00624过表达细胞中干预CHD1L和BCL9，结果显示，过表达LINC00624可促进肝癌细胞的增殖与迁移能力，而敲低CHD1L或BCL9后，过表达LINC00624所促进的肝癌细胞增殖与迁移会受到抑制，表明LINC00624通过正向调控CHD1L和BCL9两个癌基因来发挥促癌作用。
4. LINC00624与HDCA6及TRIM28相互作用促进HDAC6泛素化降解并抑制TRIM28三聚体化
为进一步阐明LINC00624调控CHD1L和BCL9表达的分子机制，作者利用RNA pull-down结合质谱，筛选出6个与LINC00624存在相互作用的候选分子，而其中仅有HDAC6和TRIM28与LINC00624具有直接相互作用，RIP实验也进一步验证了这一结论。随后分别构建LINC00624、HDAC6以及TRIM28的截短突变，通过RNA pull-down和RIP实验确定了LINC00624的1921-3387nt基序与HDAC6的436-836aa结构域和TRIM28的1-629aa结构域存在相互作用。
TRIM28作为E3泛素连接酶可能在LINC00624介导下对HDAC6进行泛素化修饰，促使其降解，使其无法发挥去乙酰化修饰的功能，从而解除对CHD1L和BCL9基因的转录抑制。作者基于上述HDAC6和TRIM28的截短突变，在过表达LINC00624后检测HDAC6和TRIM28各结构域的相互作用情况，发现过表达LINC00624可使TRIM28直接结合到HDAC6的泛素结合锌指结构域，促进HDAC6的泛素化降解。同时，在上述确定TRIM28与LINC00624相互作用结构域的过程中发现TRIM28的RBCC结构域（RING-B box-coiled-coil motif，该结构域对于TRIM28的三聚化以及随后形成转录共阻遏物复合体十分必要）与LINC00624相互作用密切，而过表达LINC00624会显著降低TRIM28三聚化的水平。
5. LINC00624通过抑制HDAC6-TRIM28-ZNF354C共阻遏物复合体形成促进CHD1L和BCL9表达
考虑到TRIM28是KRAB-ZNF转录因子的最主要互作蛋白，作者推测HDAC6-TRIM28复合物可能还会与KRAB-ZNF转录因子发生相互作用，通过预测CHD1L和BCL9启动子区域存在的KRAB-ZNF转录因子结合位点，筛选出ZNF354C。Co-IP实验结果证实了作者的推测，ZNF354C与HDAC6和TRIM28之间存在相互作用。进一步验证发现，过表达ZNF354C可以抑制LINC00624所引起的CHD1L和BCL9转录激活。ChIP实验结果也显示ZNF354C/HDAC6/TRIM28均可结合到CHD1L和BCL9启动子区域，而过表达LINC00624可显著抑制三者对于CHD1L和BCL9启动子区域的结合能力。由于TRIM28的环状结构域对于TRIM28与ZNF354C的相互作用也十分关键，LINC00624可能是通过占据TRIM28上的环状结构域影响HDAC6-TRIM28-ZNF354C共阻遏复合物的形成。此外，通过基因组富集分析以及ChIP实验验证，发现HDAC6-TRIM28-ZNF354C复合物除了调控CHD1L和BCL9转录，对于TNFα信号通路、低氧、EMT、核小体形成、蛋白质四聚体化、DNA复制等相关事件的关键分子转录也具有调控作用。
6. HDAC6-TRIM28-ZNF354C共阻遏物复合体水平与HCC患者不良预后负相关
为了明确HDAC6-TRIM28-ZNF354C复合物的病理学意义，作者对125对HCC及癌旁组织进行了免疫组化染色。结果显示，与癌旁组织相比，HCC组织中ZNF354C表达水平明显降低，而低水平的HDAC6、TRIM28和ZNF354C均与HCC患者的不良预后密切相关。提示HDAC6-TRIM28-ZNF354C共阻遏复合物具有抑癌作用，而与该复合物密切相关的LINC00624则具有成为HCC临床治疗靶标的潜力。
7. 总结
上述研究结果表明，LINC00624作为分子诱饵，通过与HDAC6和TRIM28发生相互作用，诱导HDAC6发生泛素化降解，并影响TRIM28的三聚体化，干扰HDAC6-TRIM28-ZNF354C共阻遏复合物与特定基因组位点的结合，促使多种HCC发生发展相关基因的表达。提示可通过靶向LINC00624，抑制多种癌基因的持续表达，为肿瘤临床治疗提供新靶点。
Reference
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3.Zack, T.I., et al., Pan-cancer patterns of somatic copy number alteration. Nature Genetics, 2013. 45(10): p. 1134-1140.
4.Kusano, N., et al., Genetic aberrations detected by comparative genomic hybridization in hepatocellular carcinomas: their relationship to clinicopathological features. Hepatology, 1999. 29(6): p. 1858-62.
5.Ma, N.F., et al., Isolation and characterization of a novel oncogene, amplified in liver cancer 1, within a commonly amplified region at 1q21 in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2008. 47(2): p. 503-10.
6.Willis, T.G., et al., Molecular cloning of translocation t(1;14)(q21;q32) defines a novel gene (BCL9) at chromosome 1q21. Blood, 1998. 91(6): p. 1873-81.
