2021.07.29 唐勇泉分享“通过干预ALDH18A1-MYCN正反馈调控环路抑制MYCN扩增的神经母细胞瘤生长”的故事

余时沧 教授

陆军军医大学西南医院

全军临床病理研究所

Recent publications

Inhibition of the ALDH18A1-MYCN positive feedback loop attenuates MYCN-amplified neuroblastoma growth. Sci Transl Med. 2020 Feb 19;12(531): eaax8694

NADP modulates RNA m6A methylation and adipogenesis via enhancing FTO activity. Nat Chem Biol. 2020 Dec;16(12):1394-1402.

Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nat Neurosci. 2019 Jan;22(1):91-105

NRF2 activation by antioxidant antidiabetic agents accelerates tumor metastasis. Sci Transl Med. 2016 Apr 13;8(334):334ra51

神经母细胞瘤（Neuroblastoma）是儿童最常见的实体肿瘤，起源于外周神经节。目前超过60%的神经母细胞瘤诊断时即为高风险肿瘤，5年生存率不过30%。神经母细胞瘤有许多基因的异常改变，其中MYCN基因的扩增发生在大约20%的神经母细胞瘤中，是目前所知的导致不良预后最重要的遗传学因素。MYCN基因表达的N-MYC蛋白一方面促进神经母细胞瘤细胞的自我更新、增值、耐药和转移，另一方面抑制神经母细胞瘤细胞分化。然而，科研工作者尽管对直接靶向N-MYC做了许多尝试，但仍然没有找到理想的靶向药物。因此，靶向N-MYC上游或下游的调控机制成为了新的研究方向。

Fig. 1 数据库中表达与MYCN扩增相关的基因，其中ALDH18A1最为显著

在多个神经母细胞瘤公共数据库中，作者通过分析MYCN扩增与不扩增之间的差异表达基因，得出9个重叠基因。又通过LASSO预后回归建模，筛选出6个与患者生存预后显著相关的基因，其中ALDH18A1较为显著。GSEA基因簇富集分析显示ALDH18A1的高表达组有MYC通路基因集的富集。人体组织学也证实了ALDH18A1的表达与MYCN扩增相关。鉴于已有研究表明ALDH18A1与肿瘤的脯氨酸代谢和增值相关，所以ALDH18A1可能是N-MYC功能调控的重要分子。

Fig. 2 ALDH18A1与多个临床预后因素相关

通过大样本量人体神经经母细胞瘤组织样本的免疫组化和临床信息分析，证实了神经母细胞瘤组织中ALDH18A1的高表达，并且与多个临床不良预后的因素相关，包括肿瘤分期、患儿年龄以及进展/复发。生存分析也表明ALDH18A1的高表达与患儿不良预后显著相关。

Fig. 3 ALDH18A1调控神经母细胞瘤细胞增值、自我更新和肿瘤形成

为了探究ALDH18A1在神经母细胞瘤中的功能，作者首先通过对基因表达数据集的通路富集分析，发现ALDH18A1的高表达与DNA复制和细胞周期等通路相关。随后对神经母细胞瘤细胞系中敲低和过表达ALDH18A1后的代谢组谱分析，表明ALDH18A1的表达与丝氨酸、谷氨酸等促生长氨基酸的分解代谢有关（Fig. S3）。综上，ALDH18A1的表达可能促进神经母细胞瘤的增值。随后，作者在细胞系中的稳定敲降和过表达ALDH18A1，细胞的生长曲线、3D培养下成球率、小鼠体内的成瘤速度以及肿瘤细胞的非对称分裂，证实ALDH18A1促进神经母细胞瘤细胞的增殖、自我更新和肿瘤形成的功能。

Fig. 4 ALDH18A1在转录水平调控MYCN的表达

为了进一步探究ALDH18A1促进神经母细胞瘤细胞增值和成瘤的分子机制，作者首先设想ALDH18A1可能与N-MYC有相互调控的作用。通过细胞系中ALDH18A1的敲低和过表达，以及荧光素酶报告基因实验，表明ALDH18A1促进MYCN的转录。已有研究表明MYCN的转录受到E2F/Sp1/miR29b网络的调控，在敲低和过表达ALDH18A1的细胞系中，本研究通过miRNA mimic和荧光素酶报告基因实验进一步证实Sp1/miR29b介导ALDH18A1调控MYCN转录的作用。

Fig. 5 ALDH18A1在转录后水平调控MYCN的表达

尽管作者采用miR29b的反义抑制链（Anti-sense oligonucleotide, ASO）进一步证实了mirR29b对MYCN转录的抑制作用，然而在N-MYC低表达的细胞中，miR29b的ASO并不能提高N-MYC的蛋白表达水平，因此作者推测ALDH18A1可能在转录后水平也存在对MYCN的表达调控作用。鉴于miRNA转录后调控基因表达的作用区域主要集中在mRNA的3’UTR端，作者又通过构建带有3’UTR尾端的MCYN荧光素酶报告基因，实验结果进一步支持上述推测。作者通过miRNA数据库和ALDH18A1不同表达水平的细胞系之间miRNA的表达差异，筛选出miR193b、miR29a和miR29b三个最显著相关的miRNA进行验证，结果表明此三条miRNA共同作用下可显著增加N-MYC的蛋白表达水平。因此，ALDH18A1通过miR193b、miR29a和miR29b在转录后水平调控MYCN的表达。

Fig. 6 N-MYC反过来也激活ALDH18A1的转录

上述已经研究了ALDH18A1通过调控MYCN表达行使生物学功能，然而ALDH18A1上游的调控机制仍然不清楚。已有研究表明c-MYC可上调ALDH18A1的表达，而c-MYC与N-MYC是同一家族成员且结构类似，因此作者推测MYCN可能对ALDH18A1的潜在调控作用。通过在细胞系中敲低和过表达N-MYC，细胞ALDH18A1的蛋白表达水平也随之改变，因此N-MYC可促进ALDH18A1的表达。N-MYC作为转录因子，可直接调控下游基因的转录。作者首先通过N-MYC的DNA结合序列预测了ALDH18A1转录起始区域的两个潜在的结合位点，又通过截短转录起始区域的荧光素酶报告基因的方法，表明N-MYC与ALDH18A1转录起始区域结合的位点在-40bp至-27bp之间,进一步的凝胶迁移实验和CHIP实验证实了N-MYC与ALDH18A1启动子直接结合进而促进ALDH18A1的转录。

Fig. 7 计算机模拟分子对接筛选ALDH18A1小分子抑制剂

通过计算机模拟分子对接，筛选出一批可能与ALDH18A1有潜在结合能力的小分子药物，又通过细胞系实验，表明YG1702对神经母细胞瘤细胞有杀伤作用。又通过计算机2D和3D建模，以及等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry, ITC），证实YG1702与ALDH18A1蛋白分子的相互作用。

Fig. 8 YG1702抑制神经母细胞瘤MYCN的表达以及增值和肿瘤形成

为了进一步验证YG1702潜在的临床应用价值，作者首先在细胞系中证实YG1702可抑制N-MYC的蛋白表达，又通过细胞系、3D克隆以及小鼠体内实验，证实YG1702抑制神经母细胞瘤细胞增值和肿瘤形成的作用。

总结：本研究中作者充分利用了公共数据库、前人的研究基础及计算机建模的便利，在课题设计和思路推进过程中都发挥了重要的作用。然而采用这种方法课题模块的衔接中可能不够严谨。本研究通过公共数据库分析筛选出ALDH18A1为MCYN扩增的神经母细胞瘤的潜在治疗靶点，随后探究了ALDH18A1与MYCN相互调控的分子机制，最后通过计算机建模筛选出ALDH18A1的小分子抑制剂YG1702，并验证了YG1702潜在的临床价值。本研究临床转化价值突出，但分子机制不够完美。