2021.09.17 贺凯分享“肌酸通过激活Smad2/3可促进癌症转移”的故事

研究背景

转移是癌症患者死亡的主要原因。结直肠癌(CRC)是常见的死亡原因的癌症，约10%到35%的CRC患者在诊断时存在转移，70%的CRC患者最终出现肝转移，而大多数CRC肝转移患者如未得到及时治疗会在6-20个月内死亡。肌酸被广泛用于提升肌肉质量和功能，对运动员和健美运动员而言，是最受欢迎的营养补充剂之一。膳食肌酸补充剂已用于临床试验，以逆转CRC患者的体质，尽管结果表明肌酸的摄取不能改善患者的肌肉功能或生活质量。此外，有结果显示，使用皮下注射小鼠模型研究发现肌酸的摄取可抑制肿瘤生长，故而肌酸也成为了抗肿瘤补品。然而，皮下注射小鼠模型在临床上与肿瘤进展的研究并不相关，且肿瘤的生长并不总是与转移有关。因此，详细研究肌酸如何影响肿瘤进展仍有着重要意义。

1.肌酸促进肿瘤转移

为了详细研究肌酸如何影响肿瘤进展。作者通过在NSG小鼠盲肠末端构建HCT116细胞及患者来源的PDX肿瘤模型(图1A)，同时随机分组，饲养补充肌酸观察肌酸对肿瘤转移的影响。发现肌酸对原发性肿瘤生长无明显抑制作用(图1B,C)，但通过对肌酸的摄取显著增强了肿瘤肝转移(图1D,F)，同时作者做了另外的实验，看肌酸对小鼠的生存有何影响，发现肌酸的摄取还显著缩短了肿瘤小鼠的存活时间(图1F,G)。

作者进一步将带有荧光素酶标记的CT26细胞注射到BALB/C小鼠的盲肠末端，通过生物发光成像发现，食用肌酸的小鼠比对照小鼠出现更多的肝微转移，并显著减少荷瘤BALB/C小鼠的生存时间(图1H,I）。此时问题来了，肿瘤转移是否一定由细胞对肌酸的摄取造成呢？作者在HCT116，CRC57，CT26细胞中敲除肌酸转运蛋白SLC6A8后，发现再补充肌酸不能促进肿瘤的转移(图1J,K,L)。提示肌酸通过肌酸转运蛋白SLC6A8进入细胞促进肿瘤转移。

Fig 1.Creatine promotes tumor metastasis

2.GATM在CRC肝转移中上调

既然肌酸可促进肿瘤转移，那么肌酸促进肿瘤转移的关键是什么？肌酸既可以通过外源性的摄取，也可以内源性的合成，通过甘氨酸脒基转移酶(GATM)及胍基乙酸N-甲基转移酶(GAMT)介导的两步酶促反应合成(图2A)，因此作者进一步分析了肌酸合成及摄取相关蛋白GATM，GAMT，SLC6A8和CK同工酶(包括CKMT2，CKM和CKB)的基因表达，发现与原发肿瘤相比，肝转移肿瘤细胞中的GATM及GAMT被上调，而CKMT2，CKM，CKB和SLC6A8则保持不变(图2B)。对NCBI中病人样本的数据分析同样显示GATM在肠癌肝转移组织中明显上调(图2C)。

Fig 2.GATM is upregulated inCRC liver metastases

3.GATM促进CRC肝转移

GATM在肝转移中显著上调，那么GATM会对肝转移产生何种影响？为了研究GATM表达是否与CRC进展相关，作者通过肿瘤微阵列(TMA)免疫组化染色检查了GATM表达，发现与原发肿瘤相比，GATM表达不仅在肝转移中且上调(图2I)，且在CRC晚期患者体内的表达水平也明显高于早期患者(图2 J)。TCGA数据库中的438例I至IV期的CRC患者的肿瘤样本显示，与低水平的GATM患者相比，GATM高表达的CRC患者生存时间明显缩短(图2 K)，生存率分析表明，高水平的GATM与患者不良预后相关(图2 L)。提示GATM是导致肠癌肝转移的一个重要因素。

Fig 3.GATM promotes CRC liver metastasis

4.GATM敲除可显著抑制CRC肝转移，靶向GATM延长小鼠存活期

为了进一步证实GATM是否调节CRC转移，作者在CRC细胞系HCT116，CRC57和CT26中过表达以及敲减GATM。发现过表达GATM后可促进肝转移，GATM敲减可显著抑制CRC肝转移，添加肌酸可回复CRC的肝转移(图3 A,B,C,D,E,F),同时在小鼠体内进行验证（图3J,H,I,G）。那么GATM促进CRC肝转移是否与其酶活直接相关？作者进一步在HCT116，CRC57和CT26细胞中高表达GATM及酶失活的DGATM，使用上述细胞构建小鼠肿瘤模型。发现敲减GATM显著抑制肠癌肝转移，回复GATM表达可促进肠癌肝转移，但添加酶失活的DGATM则对敲减GATM导致的肝转移降低无影响(图3 K,L)。作者还在敲减GATM基础上给予CRC一线化疗药物5-氟尿嘧啶，发现单独敲减GATM可延长小鼠存活时间，GATM敲减后在使用5-氟尿嘧啶治疗可进一步提高小鼠存活率(图3 M,N)，提示靶向GATM可与目前用于CRC治疗的化学疗法互补。

5.肌酸和GATM激活Smad2/3信号传导

肌酸促进肿瘤的转移，那么肌酸通过影响什么信号通路调控肝癌细胞转移？作者通过磷酸化多通路谱分析阵列发现，肌酸显著激活Smad2(图4A,B)，Smad2是TGF-β信号通过的关键效应蛋白。作者使用肌酸处理HCT116和CT26细胞后，检测TGF-β信号通路中关键Smad蛋白的磷酸化水平。发现肌酸不仅激活Smad2，还可激活Smad3(图4C)。GATM的高表达也可增加Smad2和Smad3的磷酸化水平(图4 D)。作者通过RT-PCR检测包括Snail，Slug，Vim，Zeb1，Twist1，Tcf3，Six1，Zeb2和Foxc2在内的Smad2/3下游靶基因，发现Snail和Slug是肌酸处理后上调最明显的基因(图4 E)。Western和免疫组化进一步证实肌酸可使Snail和Slug表达增加(图4 F,G)，提示肌酸通过激活Smad2和Smad3上调Snail和Slug促进肠癌的肝转移。

Fig 4.Creatine activates Smad2/3 signaling

6.肌酸通过MPS1激活Smad2/3信号传导

Smad蛋白是TGF-β信号途径的关键蛋白，TGF-β通路的两个受体分别为TGF-β受体1(TGFBR1)和TGF-β受体2(TGFBR2)，TGFBR2使TGFBR1磷酸化，TGFBR1使Smad2和Smad3磷酸化，作者发现TGFBR1抑制剂不影响肌酸诱导的Smad2/3磷酸化。提示，肌酸诱导的Smad2/3磷酸化必须通过除TGF-β受体以外的其他因素发生。据报道，单极纺锤体1(MPS1)是一种与有丝分裂进程和纺锤体检查点信号相关的蛋白激酶，可独立于TGF-β受体磷酸化Smad2和Smad3。

那么肌酸是否促进MPS1介导的Smad2/3磷酸化？作者将MPS1抑制剂MPS1-IN-3应用于CRC细胞系HCT116和CT26和乳腺癌细胞系4T1。Western印迹显示MPS1-IN-3可有效消除肌酸诱导的Smad2/3磷酸化(图6 A)。作者敲除HCT116，CT26和4T1细胞中的MPS1，并用肌酸处理细胞后发现，敲除MPS1后，肌酸不能增强Smad2/3磷酸化(图6 B)。T686是人MPS1激活的关键位点。因此，作者构建了该位点突变的MPS1，并将野生型和突变型MPS1转入MPS1敲除的HCT116细胞。结果显示，转入野生型MPS1后，肌酸可显著提高胞内Smad2/3磷酸化水平。但在MPS1敲除的细胞中转入突变体MPS1，肌酸不能激活Smad2/3(图6C)。提示肌酸通过人MPS1中的T686位点激活Smad2/3。

Fig 5.Creatine promotes cancer metastasis throughMPS1-activated Smas2/3 signaling

7.MPS1抑制剂抑制肠癌细胞肝转移并延长小鼠生存期

肌酸通过人MPS1中的T686位点激活Smad2/3，从而使Snail和Slug基因上调导致肿瘤转移，那么抑制MPS1是否能抑制肌酸增强的肿瘤转移并提高生存率？作者使用MPS1敲除的HCT116，CT26和4T1细胞构建小鼠肿瘤模型，添加肌酸喂养小鼠。发现MPS1敲除可抑制肌酸增强的癌细胞转移(图7 A,B,C,D)，抑制Snail和Slug表达(图7 E,F)和肿瘤细胞侵袭(图7G)。此外，MPS1-IN-3处理可显著延长小鼠存活时间(图7 H)。提示，对MPS1的抑制可抑制肌酸增强的肿瘤侵袭和转移，并延长荷瘤小鼠的存活。

Fig 7.MPS1 inhibitor suppresses liver metastasis andprolongs mouse survival

总结

本篇论文研究发现肌酸通过单极纺锤体1(MPS1)激活Smad2和Smad3磷酸化，上调Snail及Slug表达，促进癌症转移，并降低小鼠生存率。该研究应慎用肌酸这一营养补充剂，提示在结直肠癌，特别是TGFβ受体突变的结直肠癌中，敲除GATM或抑制MPS1可抑制肿瘤转移，有利于生存，GATM及MPS1可作为结直肠癌治疗药物开发的重要靶点。